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超低温冰箱在高山冰缘植物抗冻蛋白分离的应用

点击次数:991    发布时间:2017-05-04

   抗冻蛋白zui早在南极鱼类中发现,是一类能够抑制冰晶生长的特殊蛋白.由于抗冻蛋白分布的不普遍性,很难从特定几种植物中找到,并且传统的质外体提取技术难掌握。

   先将液氮保存的高山冰缘植物叶片高山红景天、高山早熟禾、高山离子芥、株芽蓼利用液氮进行研磨,研磨得到的粉末用PH8.0磷酸缓冲液混匀,并12000g离心10分钟,取上清,此为可溶性蛋白粗提液,将45毫升粗提液放入50毫升小烧杯5在层析冷柜低温4℃保存待用。用高压氮气通过减压阀门20.1兆帕压力顺导管3流经液氮进行探头预冷,探头浸入含蛋白粗提液的50毫升小烧杯5进行冻冰吸附,内放转子进行磁力搅拌保持溶液均匀。

  当烧杯内液面下降5毫升后取出冻冰探头7,室温融化冰晶,补加磷酸缓冲液至45毫升,重复用探头冻冰吸附一次。第二次冻冰的冰晶室温融化,利用截流量5000道尔顿的透析袋在无离子水中脱盐12小时,每隔2小时换水,脱盐后透析袋埋入PEG8000的粉末中浓缩。浓缩后的蛋白溶液用用考马斯亮蓝G250比色法测定浓度,用BSA做标准曲线。将定量后的蛋白用20%蔗糖溶液稀释成1mg/L5mg/L浓度,滴加到一载玻片,覆盖一盖玻片压成均匀液膜。将制片放入上海田枫-70℃超低温冰箱内30分钟冻冰后,通过塑料泡沫板13操作入口迅速将制片11放到显微镜9载物台,通过照相目镜子10操作观察口观察中向盖玻片上加一滴二甲苯,100倍油镜观察,调整视野,重结晶15分钟后放上照相机照相记录,发现高山离子芥和株芽蓼具有抑制重结晶的活性.

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